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《流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识(2016年版)》

更新时间: 2020-01-25   浏览次数:

  流式细胞学(FCM)免疫分型在血液肿瘤诊断、亚型分析以及微小残留病(MRD)检测等方面发挥越来越重要的作用。恶性淋巴瘤的诊断难度较大,需要综合血液病理学与临床特征方能做出精确诊断。在发达国家,FCM已成为淋巴瘤诊断分型的常规病理技术之一,而在国内,该技术仅广泛应用于骨髓、外周血和体液标本,实体组织或穿刺物的免疫分型工作尚未得到普及开展。

  中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会为了提高国内非霍奇金淋巴瘤(NHL)的诊断和治疗监测水平,促进多学科合作在淋巴瘤诊疗中的发展,组织专家在国内首次制订了《流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识》。本文着重从FCM技术用于淋巴瘤免疫分型的分析思路及不同病种的免疫表型特点对共识进行解读。

  有些淋巴瘤是可以用FCM 明确诊断的,主要包括急性淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤(ALL/LBL)、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)、毛细胞白血病(HCL)、浆细胞肿瘤(PCN)、T大颗粒淋巴细胞白血病(T-LGL)、NK细胞-慢性淋巴增殖性疾病(NK-CLPD)、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)等。这些淋巴瘤常以白血病形式存在并具有特征性免疫表型,其中ALL/LBL属于幼稚B淋巴细胞肿瘤,未在共识中作进一步介绍。

  共识同时也指出了一类可以利用FCM 辅助诊断的淋巴瘤,如边缘区淋巴瘤(MZL)、滤泡淋巴瘤(FL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症(LPL/WM)、Burkitt淋巴瘤(BL)、外周T细胞淋巴瘤非特指性(PTCL,NOS)、肝脾T 细胞淋巴瘤(HSTL)、蕈样霉菌病/Sezary综合征(MF/SS)和血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤(AITL)等。这些淋巴瘤虽然免疫表型不具有特征性,FCM 检出异常细胞时仍然可以作为形态学、遗传学的重要补充,起到辅助诊断的作用。

  FCM-MRD技术在NHL中主要用于以白血病形式存在或者出现骨髓浸润的B细胞淋巴瘤,T/NK细胞淋巴瘤与正常淋巴细胞在抗原表达模式上存在较大程度的重叠,且常缺乏明确的克隆性依据,导致检测灵敏度过低,限制了该技术在这组疾病MRD监测中的应用。理论上只要初发时在骨髓或外周血中能检出肿瘤细胞,并且具有淋巴瘤相关免疫表型,治疗后均可进行MRD检测。对于CLL,根据ERIC报道,如采用6或8色方案,获取白细胞总数达2×106时,FCM 检测MRD的灵敏度可达10-5。

  其次是MCL和HCL,这2种类型淋巴瘤MRD检测的灵敏度也可达10-4。FCM和PCR技术显示出高度的一致性,可以相互补充。由于CD20等单克隆抗体在治疗中的广泛应用,数据分析时应紧密结合临床,不能仅跟踪CD20阳性细胞群体,否则易造成假阴性结果。

  正常淋巴细胞的免疫表型特征是识别NHL细胞的基础,与正常对照相比,肿瘤细胞的某些抗原可以表现为表达量增强(ST)、减弱(Dim)甚至缺失,可以出现异常抗原表达、某些亚群的严重失调,也可以表现为散射光的改变。共识中推荐了NHL检测的一、二线抗体。一线抗体的作用是确定是否存在异常淋巴细胞以及异常细胞的系列来源;二线抗体的作用则是进一步分析异常细胞的免疫表型,以期明确NHL的亚型。

  几乎所有B淋巴细胞都表达CD19,成熟B细胞不表达幼稚抗原如末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)、CD34和CD10,表达CD20、CD22、CD79B和膜表面免疫球蛋白(SIG),部分表达CD5和CD38(低水平)。正常成熟B 细胞SIGκ和SIGλ比值在1:3和3:1之间。

  生发中心来源或者幼稚的B淋巴细胞表达CD10,但不表达BCL-2。FCM 识别异常成熟B淋巴细胞的依据主要有:①免疫球蛋白轻链限制性表达或双阴性:κ:λ>3:1或<1:3,或者κ和λ均不表达。κ和λ双阴性时,如果使用不同克隆或者多克隆的抗体复查仍为阴性,建议进一步行胞浆轻链检测,以除外良性增生的B细胞可能。SIGκ和SIGλ双阴性可见于ALL/LBL、CLL、原发纵膈的B细胞淋巴瘤,部分弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和浆细胞肿瘤等。

  浆细胞肿瘤多为胞浆免疫球蛋白轻链限制性表达。需要注意的是SIGκ或SIGλ的限制性表达不能等同于克隆性或者肿瘤性增生,文献报道在儿童扁桃体和多中心Castleman病中可检出λ轻链限制性表达的成熟B淋巴细胞,老年患者外周血或骨髓中可发现少量CLL样细胞群,应当紧密结合临床、形态学及遗传学等资料做出判断。②抗原表达异常:包括CD19、CD20、CD22、CD79B、CD45、CD200等抗原表达增强或减弱;异常表达CD5、CD38;表达非同步抗原CD10+BCL-2+;表达跨系抗原如CD13、CD33、CD15等,hk880四肖中特降低西医开具中药发生频率较低,LPL中相对多见。③散射光异常:前向散射光(FSC)和(或)侧向散射光(SSC)改变。FSC检测的是细胞直径,当细胞形状规则时,FSC 的信号强弱与细胞大小呈正比;SSC则反映细胞内部的颗粒、空泡及膜表面的绒毛等特征。

  此外,CD5还可表达于极少数(约5%)MZL和LPL中。FSC中等或大的CD5+NHL主要有MCL、部分PLL(20%~30%)和少数DLBCL(约10%)。PLL和DLBCL表型多样,FCM 无法直接诊断,DLBCL 以CD19dim多见。小部分PLL 由CLL/SLL转化而来,这部分患者的免疫表型与CLL/SLL相比,可以表现为CD5表达减低,CD20和sIg升高并且获得FMC-7的表达,也可以表现为与CLL/SLL相同的免疫表型。②CD5-CD10+:FSC小的NHL 主要指FL,常CD10+BCL-2+且CD19dim;FSC中等/大的NHL 主要见于BL 和30%~60%的DLBCL。FCM 很难区分CD10+的BL、DLBCL和以大细胞为主的FL(较高恶性程度的FL)。③CD5-CD10-:这一类NHL包含较多的类型。包括FSC较小的HCL、毛细胞白血病变异型(HCL-v)、MZL、LPL和脾脏弥漫性红髓小B细胞淋巴瘤(SDRPL)以及FSC中等到大的PLL、DLBCL和PCN等。HCL和HCL-v 高表达CD19、CD20、CD22和SIG,特征性地表达CD103、CD11C和FMC-7。HCL表达CD25和CD123,后者则双阴性。有文献报道CD180在MZL和SDRPL中表达明显高于其他类型NHL,尤其是SDR-PL。④CD5+CD10+:这一类型的NHL不常见,共识中未单独列出。这一组疾病包括少数DLBCL、FL、MCL、CLL/SLL和BL等,发生频率依次减少。B-NHL推荐的一线、κ和λ,分析B淋巴细胞表面上述抗原的表达结合散射光情况,可以初步判断是否存在异常B淋巴细胞。例如,发现CD19dimCD20+、FSC较大且κ或λ限制性表达的细胞群体时,应怀疑大B细胞淋巴瘤可能;发现κ或λ限制性表达的CD5+CD19+细胞群体时,应怀疑CLL/SLL或者MCL。

  跟B-NHL比较而言,FCM 识别异常T/NK淋巴细胞往往要困难一些。因为缺乏克隆性依据,TCRγ/δ+T淋巴细胞和NK细胞尤其困难。另外,有特征性免疫表型的T/NK 淋巴瘤不多,FCM 还不能实现大范围对T/NK淋巴瘤的亚型进行区分。正常成熟T细胞表达泛T细胞抗原如CD3、CD2、CD5 和CD7,表达CD4 或CD8,外周血中CD4+CD8+和CD4-CD8-细胞比例极低,TCRα/β+细胞为主(占T细胞的95%以上)。

  TCRα/β+T淋巴细胞是否为克隆性增殖可以通过检测TCRvβ表达谱来判断,现有的TCRvβ试剂盒约可覆盖70%的家族成员,正常情况下24种抗原散在表达且抗原之间不共阳性。克隆性的T淋巴细胞可以表现为单一种类TCRvβ抗原的增殖或者24种抗原表位总和明显减低(可间接提示克隆性)。当异常T 淋巴细胞表达CD16、CD56或CD57等NK细胞标记时,也可以通过检测杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIRS)来判断克隆性,尤其是T淋巴细胞受体类型为TCRγ/δ时。

  T淋巴细胞出现以下情况时要考虑NHL可能:①CD4/CD8比例失衡,大于10:1或小于1:10,病毒感染时可见CD8+T细胞的大量扩增且伴有CD7表达下调,注意鉴别。②CD4+CD8+或CD4-CD8-T淋巴细胞比例升高。③泛T细胞抗原表达异常,CD3、CD5、CD7表达异常较为常见,CD2相对少见。抗原表达以减低或缺失多见,少数患者可以表现为抗原表达上调。④T细胞中某些抗原表达异常升高,如CD16、CD56、CD57、CD25、CD279等。⑤伴异常抗原表达,如CD30、CD10、CD20、CD103、CD13和CD33等。⑥TCRvβ系列抗原表达谱呈单克隆性增殖或全阴性。根据CD4和CD8的抗原表达情况可将T细胞淋巴瘤分为以下几类:①CD4+CD8-:多见于MF/SS,ATLL,AITL,T-PLL,PTCL(NOS),间变大细胞淋巴瘤(ALCL),以及罕见的CD4+LGL。

  MF/SS常表现为CD4+CD7-CD26-CD28+,CD25可见不同程度的表达;ATLL通常CD4+CD7-,CD25均一性强表达,人类T细胞白血病病毒(HTLV-1)阳性;AITL 除了表达泛T 淋巴细胞抗原CD2、CD3、CD5 外,特征性地表达滤泡辅助T 细胞(TFH)相关抗原CD10、CXCL13和PD-1(CD279),胞膜CD3可以弱表达或阴性;T-PLL多数(约60%)为CD4+CD8-,少数(约25%)为CD4+CD8+,CD4-CD8+较少见(约15%),不表达CD25,胞膜CD3可见弱表达,CD52强表达,70%~80%的患者表达CyTCL1(其他类型T-NHL一般为阴性);ALCL 一般FSC较大,最常见表达CD2,CD30+CD25st,可以表达CD4或CD56,CD3、CD5、CD7等泛T细胞抗原常缺失,约75%的患者缺失胞膜/胞浆CD3,由于缺失多个泛T细胞抗原,免疫上常表现为“null cell”表型,基因检查可以帮助明确T细胞来源;PTCL(NOS)常见CD4+,CD5和(或)CD7可以表达缺失,需要除外其他类型淋巴瘤后方可诊断为这类疾病。②CD4-CD8+:最常见于T-LGL,还可见于皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤(SPTCL),部分CD8+PTCL(NOS),小部分TPLL,少数CD8+HSTL和非肝脾γ/δT 细胞淋巴瘤,罕见MF/SS。T-LGL常见CD8+,CD5和(或)CD7弱表达,常表达细胞毒性颗粒相关蛋白如TIA-1、颗粒酶B和穿孔素,80%以上的患者表达CD57和(或)CD16,少数表达CD56,绝大多数TLGL为TCRα/β类型,少数表达TCRγ/δ,CD4+变异型T-LGL较少见且恶性程度较高。SPTCL是一种少见的细胞毒性T细胞淋巴瘤,CD8+CD56-,表达TIA-1、颗粒酶B和穿孔素。③CD4+CD8+:在成熟T淋巴细胞肿瘤中,最常见的是T-PLL,免疫表型上需与CD4+CD8+的T-ALL 鉴别。TPLL不表达CD1A和TDT等幼稚T淋巴细胞标记,而T-ALL常为阳性。④CD4-CD8-:常见于HSTL,非肝脾γ/δT 细胞淋巴瘤,肠病相关性T细胞淋巴瘤(EATCL),也可见于PTCL(NOS)。

  HSTL通常CD3+CD4-CD8-CD5-,表达CD56,不同程度表达CD16,一般不表达CD57,表现为非激活性细胞毒性表型(表达TIA-1,不表达颗粒酶B和穿孔素),绝对大多数患者为TCRγ/δ+且表达vδ1表位。EATCL通常CD3+CD7+CD5-CD4-CD8-CD103+,表达TIA-1、颗粒酶B和穿孔素,不同程度表达CD30,CD56+/-,多表达TCRα/β。

  绝大部分NK 细胞CD3阴性,CD16和CD56共表达,表达CD2和CD7,不表达CD4,一般不表达CD5,部分表达CD8和CD57,大部分NK 细胞CD56dim,少部分CD56st。通常选择CD158a/h,CD158b、CD158e、CD158f、CD158k和CD158i等KIR系列抗原用于NK细胞克隆性检测,正常NK细胞各种抗原散在表达,抗原之间可以共表达,单一表达某一种抗原或者全阴性均可视为克隆性增殖。CD56dim细胞杀伤活性强,而CD56ST细胞群以分泌细胞因子为主。

  NK细胞淋巴瘤主要有3类:NK-CLPD,侵袭性NK细胞白血病(ANKL)和结外NK/T淋巴细胞淋巴瘤鼻型(ENTCL)。NK-CLPD的细胞通常CD3-CD56dimCD16+,表达TIA-1、颗粒酶B和穿孔素,可见CD5异常表达,CD8均一性表达或完全缺失,CD2、平特王论坛。CD7和CD57常表达下调或缺失,KIR系列抗原可呈克隆性增殖。ANKL一般CD3-CD56stCD2+,CD7和CD57常为阴性,CD16常为阳性,与EB病毒感染高度相关。ENTCL除CD16阴性外,其余免疫表型与ANKL相似。

  NK/T-NHL推荐的一线,用于初步筛查是否存在异常NK/T细胞群体;二线、TCRαβ、TCRγδ、穿孔素、颗粒酶B和CTIA-1等,进一步对异常NK/T淋巴细胞亚型进行鉴定。

  共识中还详细描述了FCM技术的结果分析和报告以及质量控制等内容,本文不再赘述。利用图1和图2展示了正常淋巴细胞及几类典型NHL的免疫表型特点。

  虽然许多类型淋巴瘤的诊断依然高度依赖组织、器官病理学的检查,FCM在识别伴有异常免疫表型的淋巴细胞方面具有高特异性、高灵敏度及快速客观等优点,必将成为传统病理技术的重要补充,促进综合诊治淋巴瘤的发展。本文围绕《流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识(2016年版)》进行解读,重点对有特征性免疫表型的NHL病种进行了描述。希望能为广大临床、病理医生以及从事FCM相关工作的同行们提供一些帮助,也希望可以推进FCM技术在多学科中的应用。

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